Podocyte Exact Morphology Measurement Procedure

PEMP – Revolutionäres Verfahren zur Analyse der Podozytenfußfortsätze von Nicole Endlich, Greifswald     Zehn Prozent der Menschen weltweit sind bereits an der Niere erkrankt und die Tendenz ist vor allem durch die Zunahme des Bluthochdrucks und des Diabetes mellitus stetig steigend [1]. In vielen Fällen ist die chronische Nierenerkrankung auf Veränderungen oder den Verlust von Podo­zyten zurückzuführen.   Podozyten, hochspezialisierte Epithelzellen der Niere, sitzen den Kapillaren in den Glomeruli von außen auf und ragen in den Bowmanschen Kapselraum hinein. Zusammen mit den Endothelzellen der glomerulären Kapillaren und der glomerulären Basalmembran (GBM) bilden sie die sogenannte Filtrationsbarriere, die in gesunden Nieren nur für Substanzen bis zu einer Größe von 5 kDa vollständig durchlässig ist [2]. Über ihre feinen Zellausläufer und den daran anschließenden Fußfortsätzen sind die Podozyten auf der GBM verankert und interdigitieren reißverschlussartig mit den Fußfortsätzen der Nachbarzellen. Zwischen diesen regelmäßig ineinander verzahnten Fußfortsätzen ist in der gesunden Niere durch das Trans­mem­branprotein Nephrin eine sogenannte Schlitzmembran ausgebildet. Mutationen oder gar der Verlust des Proteins bzw. der Schlitzmembran führt sehr schnell zu einem Verlust der Größenselektivität der Filtrationsbarriere und hat die Ausscheidung von höhermolekularen Proteinen zur Folge [3], was in der Klinik oder nephrologischen Praxis der beobachteten Proteinurie entspricht.   Aber auch die Veränderungen dieser komplexen 3D-Struktur der Podozytenfußfortsätze führen unweigerlich zum Verlust der Filterfunktion der Niere. Somit korrelieren Morphologie und Funktion direkt miteinander. Ein klassisches Beispiel hierfür ist die Minimal-Change-Glomerulonephritis (MCGN), die vorwiegend Kinder und Jugendliche betrifft und direkt auf Veränderungen der Morphologie der Podozytenfußfortsätze zurückzuführen ist. Bei der MCGN verbreitern sich die sonst so filigranen Fußfortsätze, was man als Effacement bezeichnet.   Da die Fußfortsatzbreite unterhalb der optischen Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops ist, ließen sich bislang solche Veränderungen der Podozytenfußfortsätze nicht anhand standardhistologischer Schnitte untersuchen und nachweisen. Solche ultrastrukturellen Veränderungen der Podozytenmorphologie konnten bisher nur mithilfe der hochauflösenden Elektronenmikroskopie gezeigt werden. Diese Technik ist allerdings präparativ und zeitlich sehr aufwendig und nicht für eine größere Anzahl von Proben geeignet. Ferner ist es nur mit hohem Aufwand möglich, die Verbreiterung der Füßchen zu quantifizieren. Zudem ist die Methode leicht anfällig für Fehlinterpretationen und muss daher immer von einem erfahrenen Pathologen durchgeführt werden.   Im Jahr 2017 konnte unser Team ein Verfahren etablieren, das es erlaubt, schnell, exakt und quantitativ die Veränderungen der Morphologie der Podozyten darzustellen [4]. Das Verfahren beruht auf der neu entwickelten Technik der Superresolution-Mikroskopie. Dabei wird die Technik der strukturierten Beleuchtung, SIM, angewendet, welche eine optische Auflösung von ungefähr 100 nm erreicht. Dazu wird ein 3–4 µm dicker Gewebeschnitt einer Biopsie oder einer Nagetierniere, die standardmäßig in Paraffin eingebettet wurde, auf das Schlitzmembranprotein Nephrin unter Verwendung eines Standardfluoreszenzfarbstoffs (Cy3, Cy2 etc.) gefärbt. Mit unserem Verfahren PEMP (Podocyte Exact Morphology Measurement Procedure) wird daraufhin die gefärbte Schlitzmembran der Glomeruli als sogenannter z-Stack aufgenommen und zu einem hochauflösenden 3D-Bild verarbeitet (Abbildung 1). Anschließend werden die zu bestimmenden Bereiche markiert, die gefärbte Schlitzmembran mittels eines Softwareprogramm als durchgängige Linie erkannt und die Länge des Filtrationsschlitzes pro Fläche bestimmt. Dieser Wert ist die Filtrationsschlitzdichte (FSD) und gibt eine Aussage darüber, inwieweit die Fußfortsätze der Podozyten verändert sind. Je geringer die FSD, desto breiter sind die Fußfortsätze [3, 5, 6].   PEMP erlaubt erstmals die quantitative Auswertung der Fußfortsatzmorphologie in kurzer Zeit und an vielen Glomeruli. Während aktuell für eine diagnostische Beurteilung der Nierenmorphologie nur sehr kleine Ausschnitte mit 1–3 Glomeruli verwendet werden, bewertet PEMP große Bereiche der Biopsie und berechnet aus mindestens 12 Glomeruli den spezifischen Wert. Dies ist besonders wichtig bei fokalen und segmentalen Veränderungen der Niere, wie es bei der FSGS (fokal segmentale Glomerulosklerose) der Fall ist. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass man dieselben Biopsien gleichzeitig auf verschiedene Biomarker färben und die Expression dieser Biomarker in Relation zu dem Ausmaß des Fußfortsatzeffacements, d. h. der FSD, setzen kann. Dieses Verfahren bietet neue Möglichkeiten einer personalisierten Diagnostik, ist aber auch für die Analyse von Tiermodellen direkt anwendbar und daher für die Forschung und Entwicklung von Medikamenten von sehr großer Bedeutung.   Was kann PEMP nun für Patienten leisten?   Patienten erhalten einen individuellen Wert ihrer Podozytenveränderung, bestimmt an einer großen Zahl von Gewebebereichen. Bei jeder Biopsie kann gleichzeitig die Expression von Biomarkern bestimmt werden und in ein Verhältnis zur FSD gestellt werden, was perspektivisch die Prognose und Therapie beeinflussen kann. Die FSD kann mit den klinischen Daten der Pa­tienten korreliert werden und gibt wichtige Hinweise, die in der Forschung und für die Prognose genutzt werden können. Transplantate können in Follow-up-Analysen genau untersucht werden. Auch hier kann das Wissen um die aktuelle Fußfortsatzmorphologie die Therapie beeinflussen und wichtige Informationen liefern.   Was kann PEMP für die Forschung leisten? Durch eine präzise und quantitative Bestimmung der Fußfortsatzmorphologie können erstmals die Versuchstiere in der Forschung [7] und Medikamentenentwicklung exakt hinsichtlich ihrer Podozytenveränderung ausgewertet werden.          Referenzen worldkidneyday.org Pavenstädt et al. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 2003, 83(1):253. Kaplan J, Pollak MR. Familial focal segmental glomerulosclerosis. Curr Opin Nephrol Hypertens 2001;10(2): 183–7. Siegerist F, Ribback S, Dombrowski F et al. Structured illumination microscopy and automatized image processing as a rapid diagnostic tool for podocyte effacement. Sci Rep 2017; 7(1): 11473. Artelt et al. Comparative analysis of podocyte foot process morphology in three species by 3D super-resolution microscopy. Front Med (Lausanne). 2018, 30 (5):292. Schell et al. ARP3 controls the podocyte architecture at the kidney filtration barrier. Dev Cell. 2018 17;47(6):741. Artelt N, Ludwig TA, Rogge H et al. The Role of Palladin in Podocytes. J Am Soc Nephrol 2018; 29(6):1662–78.       Bild Copyright: Science Photo Library / Alamy Stock Foto     Autorin:     Prof. Dr. rer. nat. Nicole Endlich nicole.endlich@uni-greifswald.de             aus connexi  2-2019 NEPHROLOGIE, HYPERTENSIOLOGIE, DIALYSE, TRANSPLANATION DDfN 2018, DTG 2018, DHL 2018, Berliner Dialyse-Seminar 2018 Kongressberichte       Titelbild Copyright: Science Photo Library / L. Basset / Visual Unlimited, Fotolia® Janis Smits Gestaltung: Jens Vogelsang          
 

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